Chapitre 4 – Maturation et Transport des constituants de la cellule
I – Compartimentation des cellules eucaryotes A) Introduction - ME : Permet de voir des entités < 0,2 µm. - On a beaucoup de membranes dans une cellule qui délimitent des compartiments.
1 – Présentation générale des constituants cellulaires - Le Réticulum Endoplasmique : Le compartiment le plus riche en membrane est le RE qui est continuité avec le noyau. Ce RE est un compartiment labyrinthique car il est extrêmement complexe et développé. Il est entouré d’une membrane lipidique et se localise dans le cytoplasme des cellules eucaryotes. On a ici synthèse de lipide été protéines associées au membrane… + Protéine sécrétées par la cellule et protéines envoyées ver sels lysosomes..
- Les Mitochondries présente également une membrane. Cet organite utilise l’oxygène moléculaire pour produire les molécules d’ATP : Principales sources d’énergie. Elles dérivent surement d’une bactérie ancestrale.
- Les Lysosomes : Déchetterie de la cellule – C’est un compartiment acide à cause d’enzymes qui fonctionnent à pH acide.
- Appareil de Golgi : Citernes empilées les unes sur les autres et qui joue un rôle dans le trajet des protéines dans la cellule. Lipides et protéines faites dans le RE passent dans le golgi où il va y avoir des MPT, un tri (Assignement un lieu d’arrivée à la molécule créée dans le RE.), Lieu de Glycosylation des protéines (ajout d’oses.)
- Peroxysome : Fonction et origine pas très bien défini ; Leur nom évoque le fait qu’ a l’intérieur de ses structure le dioxygène est oxydée pour former des molécule organiques. Ils contiennent des enzymes qui qui produisent ou dégradent l’eau oxygénée.
- Le Cytosquelette est formé de 3 types de Filaments qui ont des fonctions qui leur sont plus ou moins propres afin de réguler les mouvements de la cellule, les déplacements des organites et entités intracellulaires, conférer une résistance mécanique à la cellule : - Microtubule. - Filament d’Actine. - Filament Intermédiaire.
- Les organistes ne sont pas placés au hasard dans une cellule. Il y a une polarité pour interagir avec le milieu extracellulaire.
- Endosome : Vésicule qui vient de la surface de la cellule. Il est entouré d’une membrane et sont présents dans les cellules animales. Leur fonction est le transport du matériel nouvellement ingéré puis passe souvent ce matériel aux Lysozymes pour être dégradé. - Endocytose : C’est le phénomène de capture d’entités par la cellule via une invagination de la membrane plasmique et de la formation d’une véhicule formée d’une membrane. - Exocytose : C’est le phénomène inverse de l’Endocytose.
B) Organites entourés de membranes chez tous les eucaryotes. - Les mitochondries représentent environ 20% du Volume cellulaire Le REL : 6 % Le REG : 9 %
C) Origines possibles des organites. - Apparition des premières cellules : - 3,6 Milliards A vérifier. - Apparition des Mitochondries : - 1,6 Milliards. - Le Noyau et les RE se seraient formée à partir de cellules procaryotes primitives qui présentaient déjà des membranes. - Les Mitochondries seraient des cellules eucaryotes anaérobique colonisées par des bactéries aérobies capables de former de l’ATP par l’O2. Ces cellules auraient subies une invagination de la membrane plasmique pour formation la structure double membranaires actuelle.
D - Comment reconnaître la route suivie par les protéines. - Technique du « Pulse-Chase » : Traduction d’une séquence d’acide aminé (présentant des aa soufrés) que l’on synthétise en présence (quelques minutes - PAS PLUS) de Soufre 35. Les protéines que l’on obtiendra seront radioactives. On peut suivre dès lors l’évolution des protéines radioactives dans la cellule. L’évolution globale : RE Golgi Proche de la Membrane cellulaire (Présence des protéines dans des vésicules.)
- Technique du Génie génétique « Insertion d’une séquence qui code une étiquette » : L’étiquette sera couplée à la protéine et elle permettra de localiser, par émission lumineuse, la protéine d’intérêt néoformée. Cette technique permet également de purifier cette protéine d’intérêt et d’autres protéines qui lui sont associés : On identifie les partenaires de cette protéine. Injection du vecteur par Electroporation, micro-injection, Lipofection et bombardement. - La Co-localisation de 2 protéines dans différentes structure est repéré par addition des couleurs d’émission de leur propre étiquette.
- GFP : Excitation dans le Bleu, Emission dans le Vert. La découverte de la GFP a fourni des outils révolutionnaires pour le suivi des protéines.
- La limite de résolution de la MO : 200 nm. Je n’ai pas le droit de dire que 2 protéine interagissent parce qu’on les voit collées sur le MO, Il faut Faire attention à ces problème de résolution !
- Méthode Du FRET : Mise en résonnance de deux protéines, on excite dans l’une et on obtient un émission de l’autre. E) Deux routes divergentes des protéines
 1 – Via le cytosol - Les protéine synthétisées dans le cytosol peuvent-être en rétention dans le cytosol. - La plupart des protéines vont aller vers le noyau. - Une autre portion (plus petite) va se diriger vers la mitochondrie pour compléter. - Une dernière portion se dirige vers les peroxysomes (portion beaucoup plus faible) elles vont être détruite.
2 - Via le RE - Elles peuvent rester en rétention dans le RE. - Si elle ne reste pas dans le RE, elles passent dans le Golgi où elles vont : - Rester en rétention - Simplement transiter. - Après l’Appareil de Golgi, les protéines peuvent partir dans les lysosomes ou alors elles peuvent être incorporé dans des vésicules de sécrétion pour se diriger vers la surface de la cellule.
- Il y a 2 types de compartiments dans la cellule : - En lien avec le cytoplasme : Les protéines peuvent passer dans ces structures par diffusion. - Compartiment possédant une lumière : échange de protéines via des vésicules (Analogie avec les bulles de savon.)
F) Trois façon différentes d’aller à un compartiment à un autre. 1 – Transport via des pores. - Cytosol/Noyau 2 – Transport à travers la membrane - Cytosol/Mitochondrie - Cytosol/Peroxysome - Cytosol/RE. 3 – Transport via des Vésicules - RE/Golgi - Golgi / Endosome terminal - Endosome Terminal / lysosome - Golgi / Surface de la cellule - Golgi / Vésicule de sécrétion - Vésicule de Sécrétion / Surface de la Cellule
- Les membranes ne sont pas symétriques si on considère sa face interne ou sa face externe.
Comment se forme une vésicule ? - Formation d’une vésicule par bourgeonnement suivi d’une scission pour terminer cette formation. Cette vésicule va fusionner avec un compartiment cible, la vésicule va s’incorporer dans le compartiment cible.
G) Ce qui détermine le destin d’une protéine. - On a un peptide signal. - On a également des segments intra chaine (=séquence signale) qui contribuent au domaine de signalisation.
II – Le compartiment cytosolique. A) Structuration du cytosol par des filaments constituant le Cytosquelette. - Les Filaments sont visibles par des colorations. Ce réseau est indispensable pour : - La détermination de la localisation des organites - Donner : - la forme à la cellule - un mobilité à la cellule - Assurer : - une mobilité à la cellule selon une direction particulière - Assurer une protection mécanique à la cellule.
- Trois filaments aux fonctions différentes composent ce cytosquelette : - Filament d’Actine (Rouge) : Accumulation sous la membrane de la cellule - Microtubules (Vert) : structure radiante à partir du noyau. (Rayon d’une roue de Vélo) qui parcoure toute la cellule. - Filament Intermédiaire (Jaune) : Traversent la cellule en tous sens.
- Les Mouvement de la cellule sont dues au cytosquelette qui composent les structures comme les Cils ou les Microvillosité. Les Amibes utilisent leurs filaments d’Actine pour se déplacer. - C’est ainsi que toutes les cellules eucaryotes supérieures se déplacent de la manière suivante : - Une partie en avant envoie les Lamellipodes - Une fois que cette partie s’est fixée, on a une rétractation qui avance le reste de la cellule.
- Les cellules sont polarisées. Les Cellules du tubes digestifs sont un exemple parfait pour exprimer ceci : - Une Partie apicale qui va récupérer les nutriments captés dans l’intestin - Une Partie basale qui va les envoyer vers les vaisseaux sanguins.
- Voici les fonctions principales des Filaments du Cytosquelette : - L’Actine donne les Microvillosités (qui bougent) - Les MT positionnent les organites et les transportent. - Les Filament intermédiaires relient les structures d’attachement des cellules et assurent une force mécanique a la cellule. Des mutations peuvent affaiblir la capacité de ces filaments intermédiaires à donner ces forces mécanique.
1 - Les Filaments d’actine (ou Microfilaments) 1.1 – Définition - Les Filaments d’Actine sont des polymères d’une protéine globulaire (l’Actine) qui ont une forme apparente d’une hélice double brin.
1.2 – Structure - Les FA sont des structures flexibles d’une dizaine de nm. - L’Actine est le monomère composite du FA. Elle présente 8 variétés chez l’Homme qui sont codées par un gène spécifique à chaque variété. - C’est l’empilement des monomères d’Actine qui va former la pseudo-hélice qu’est le FA.
- Les Filaments d’Actine peuvent se rassembler les uns aux autres et former 3 structures : - Les Faisceaux qui présentent une organisation linéaire dans un seul plan. Cette configuration est le résultat de rassemblement de plusieurs FA via des ponts construits pas des protéines telles que la Fascine. Les cils et les Microvillosités.
- Les Réseaux qui présentent une organisation en 2 dimensions et résultent de l’action de protéines telles que la Filamine. Les globules rouges qui doivent adapter leur former à leur passage dans des petits passages (capillaires.)
- Les Gels qui présentent une organisation en 3 dimensions. - L’Actine peut s’associer par de nombreux procédés qui vont conduire à la formation de structure et de propriétés distinctes. Ces formations diverses sont induites par de nombreuses protéines associées.
1.3 – Localisation & Propriétés - La plupart des FA sont localisés sous la membrane plasmique où ils peuvent former une structure caractéristique de la cellule. - Un monomère d’actine est une protéine qui contient un sillon qui renferme une molécule d’ATP indispensable à la stabilité du monomère.
- Les FA présentent une certaine polarité car ils présentent : - Une extrémité négative (ATP accessible) - Une extrémité positive (ATP non accessible – Extrémité par lequel grandissent les filaments d’actine.) - Grâce à des ancrages et des câbles, les filaments d’actines sont accrochés à la membrane comme dans les érythrocytes chez l’Homme. - La Présence d’Actine permet également à une cellule d’interagir avec son environnement : - Les Leucocytes se déplacent par ancrage avec les Globules rouges. - Les Plaquettes sont des cellules qui vont présenter une molécule attirée par les caillots qui est reliée à l’Actine. - La Dystrophine présente dans les cellules musculaires exprime la contraction en dehors de la cellule. Cette molécule n’existe pas dans le cas de Myopathie (comme la Myopathie de Duchenne) ce qui engendre une absence de lien entre Actine et Membrane cellulaire et donc l’absence de transmission de la contraction musculaire.
2 – Les Microtubules 2.1 – Définition - C’est un Polymère d’une protéine globulaire : La Tubuline.
2.2 – Structure - Les MT sont présents sous la forme de cylindre composé de Tubuline. - Ce Filament important dans le Cytosquelette est constitué de 2 types de tubulines (α & β) qui sont codées par deux gènes différents et qui s’associent pour former un dimère d’un diamètre de 25 nm environ. - La structure du dimère de tubuline est simplement la liaison des sous-unités α et β. Cette liaison nécessite de l’énergie pour fonctionner et cette énergie est apportée par le GTP.
- La structure du dimère est faite de sorte que la tubuline α est située en dessous de la tubuline β. Cette conformation : - Bloque le site de fixation de la tubuline α (qui sera non échangeable et non ionisable) - Laisse le site de fixation de la tubuline β libre (qui deviendra échangeable et ionisable.)
- Après leur formation, plusieurs dimères vont former les Proto-filament (structure instable) qui va former une structure cylindrique pour se stabiliser : Les Microtubules. - Un MT est constitué de 13 Proto-filaments. -Il existe une troisième espèce de Tubuline que l’on appelle la Tubuline gamma. Cette protéine sert au démarrage de la polymérisation des MT.
2.3 – Localisation & Propriétés - Les Microtubules sont issus d’une structure cellulaire que l’on appelle le Centrosome (= MTOC : Centre Organisateur des Microtubules.) et ils se propagent dans toute la cellule. - Les Microtubules sont beaucoup plus rigides que les filaments d’Actine. - Les Structures sont très dynamiques et capables de s’allonger/se raccourcir très rapidement par addition ou soustraction de Tubuline. - Ces MT servent au déplacement des organites au sein de la cellule. Ils servent également lors de la séparation des Chromosomes au cours de la Mitose/Méiose par création du Fuseau mitotique.
- Les MT : - Dépolymérisent au pôle négatif - Polymérisent au pôle positif.
2.4 – Définitions supplémentaires - Centromère : Zone de séparation des Chromatides au niveau d’un chromosome. - Centrosome : Structure cellulaire qui est le point de départ des MT. - Centriole : C’est une zone du centrosome qui est formé de 9 groupes de 3 MT. Il est couplé en général avec un deuxième centriole qui lui est perpendiculaire. On constate, à proximité de ce centriole, la zone péri- centriolaire qui est dense aux électrons. Cette zone est le lieu de début de polymérisation d’un MT naissant. Dans un centrosome, il y a la plupart du temps des centrioles, mais ce n’est pas toujours vrai !
2.5 - Visualisation de la polymérisation / Dépolymérisation des MT (= instabilité dynamique des MT) Technique de Microscopie : - Filmer sous un microscope en ajoutant un molécule fluorescente (Tubuline Fluorescente par couplage avec la GFP par exemple .)
3 – Filaments intermédiaires 3.1 – Définition - C’est une grande famille hétérogène de protéines fibreuse de 10 nm de diamètre environ. - Les FI ressemblent à une corde qui forme des réseaux. - On pense que les FI dérivent d’un filament qui forme la Lamina (= Filament intermédiaire qui tapisse la face interne de la membrane du noyau - Elle est responsable de la Progeria.)
3.2 Structure - Les FI présent plusieurs types dont voici quelques exemples : - Kératine : FI relié par des ponts disulfure - Vimentine / Desmine. - Protéines Neurofilaments - Initialement, une protéine (voir les types ci-dessus) va former un dimère. Ces dimères vont s’assembler en Tétramère (2 dimères légèrement décalés l’un par rapport à l’autre.) Enfin, 8 Tétramères vont s’assembler pour former une structure de 10 nm qui se tortille pour former une structure « de corde ». - Dans le cas des Kératine, un tétramère est formé à partir d’un dimère acide et d’un dimère basique de Kératine
3.3 - Propriétés - Les FI confèrent une résistance mécanique à la cellule et répartissent les efforts mécaniques dans un épithélium en s’étirant à travers le cytoplasme d’une jonction à une autre jonction de la cellule. Epidermolyses Bulleuses : Mutation d’une kératine qui fait que la peau réagit : Formation d’une bulle qui explose lorsque la peau est en contact de quelque chose.
- On retrouve les FI dans le fibrinogène (protéine impliquée dans la coagulation.) - Interaction hydrophobe - VOIR DIAPO !!! - Mésenchyme : Tissu non spécialisé …
B) Modifications des protéines dans le cytosol - Réversibles ou non - La première étape dans le cytosol est le repliement et liaison de cofacteurs. Avec des modifications post-traductionnelles (MPT) :
1- Phosphorylation - L’Ajout d’un groupement phosphate est une MTP majeure qui peut avoir de nombreuses répercutions. - Cette phosphorylation est souvent observée sur des Serines ou des Thréonine.) - Cette phosphorylation n’est possible que par l’action de protéine- kinases (enzymes présentes par centaines) qui ont une action réversible. - On peut enlever ce groupement phosphate par un autre type d’enzyme : les phosphatases. - La phosphorylation peut avoir un certain nombre de fonctions : - Activation : Si elle est phosphorylée, elle peut interagir avec des complexes (comme l’ADNpol par exemple) et favoriser ainsi une fonction (comme l’expression d’un gène.) - Inactivation : Certaines protéines sont actives lorsqu’elles ne sont pas phosphorylées (C’est le cas de la protéine Histone H1 qui compacte la Chromatine et qui est phosphorylée avant la Mitose.) - Signalisation intracellulaire : La phosphorylation est la principale méthode de transduction du message au sein de la cellule. Elle est présente en générale sous la forme d’une cascade enzymatique.
2 -Ajout de Lipides - Cette autre MPT permettra l’accrochage notamment des protéines à la membrane. - Quand on va accrocher une protéine, un acide carboxylique d’un acide gras (présent sur la membrane cellulaire) va interagir avec le groupement Amino (N terminal) libre de la protéine pour former une liaison amide. - On peut également lier l’acide gras à une cystéine (Liaison Thio-ester) ou un groupement prényl (Liaison Farnésyl.)
- En général, un seul ancrage ne suffit pas à la fixation d’une protéine à la membrane. il faut donc coupler les différentes techniques de liaison à la membrane.
3 – Glycosylation - La Glycosylation, c’est l’ajout d’un sucre pour les protéines qui sortent de la cellule notamment. - Les Enzymes qui agissent sur ces protéines sont des complexes protéiques. - Les liaison entre ces protéines, pour former les complexes, sont contrôlée par les MPT.
C) Adoption d’une conformation par les protéines en cours de synthèse - Une fois que la protéine vient d’être synthétisée, elle n’est que partiellement repliée. - Il faudra l’action d’autres facteurs qui vont modifier de nouveau cette structure et former la protéine finale. - On peut vérifier expérimentalement que la protéine a besoin d’un peu de temps après que la protéine finale ne soit synthétisée.
- Chacun des compartiments cellulaires contient des protéines chaperons qui forment une classe de protéines ubiquitaires qui assurent la cohésion de certaines protéines. Elles aident les protéines néo-synthétisées à adopter une structure tridimensionnelle correcte.
D) Rôles des protéines chaperons dans la mise en conformation des protéines. - Chaperons : Protéines qui aident d’autres protéines pour leur éviter une mauvaise conformation qui entrainerait la formation de polypeptide inactifs ou agrégés.
- Dans le meilleur des cas, Lorsque la protéine est synthétisée elle adopte sa structure finale seule et va dans le milieu extracellulaire sans aides extérieures. - Dans la majorité des cas, nos protéines vont s’organiser incorrectement spatialement. Les protéines chaperons vont donc réguler ces organisations et s’assurer qu’il n’y ait pas formation de structure potentiellement dangereuse. - Dans certains cas, les repliements mauvais sont irréversibles et donc les protéines chaperons vont envoyer ces mauvaises protéines vers un site de dégradation : le Protéasome. La Dégradation se fera grâce à des enzymes : les protéases.
E) Protéolyse sélective par les Protéasomes/ - Protéasome : Ensemble de nombreuses protéines qui sont situés dans le cytosol et qui acquierent une activité de Lyse des protéines marquées par l’Ubiquitine. - Quand une protéine rentre dans le Protéasome, les acides aminés constituants l’ancienne protéine sortent pour être réutilisés. - Dans certains cas, les protéines mal formées ne sont pas dégradées via le Protéasome mais elles s’agrègent entre elles en amas potentiellement dangereux.
- Structure du Protéasome : - Entrée pour les Protéines ubiquitidinylée - Un Sortie pour les Ubiquitines qui sont enlevés de la protéine avant l’action des Protéases. - Une zone de contact avec les protéases - Une sortie pour les acides aminés issus de cette dégradation. - Un Protéasome présente un vitesse de Sédimentation de 25 S.
F) Protéolyse sélective par les Protéasomes. - La Protéolyse des protéines dépendant d’une étiquette. - En effet, la protéine rentre dans le Protéasome par l’entrée prévue à cet effet (Cette entrée à la forme d’un anneau de protéines qui vont dégrader l’ATP et aspirer, grâce à l’énergie apportée, la protéine dans le Protéasome.) - La Protéine Signale de dégradation la plus importante, c’est l’ubiquitine (76 acides aminés) qui constitue l’étiquette qui va informer de la dégradation de la protéine qui la porte. - Cette Protéine présente un Groupement Carboxylique qui va interagir avec les fonctions amines des Lysines. - Quand on a des protéines qui sont poly-ubiquitinylées, la protéine est aspirée dans le Protéasome, et les molécules d’Ubiquitine passent par un passage localisé avant la dégradation de la protéine. - L’ubiquitine est couplée à la Protéine par une famille d’enzymes : Les Ubiquitines Ligases. Dans cette famille, il y a 3 types enzymes. - Mode de fonctionnement des Ubiquitines-Ligase : - E1 Fixe correctement l’ubiquitine sur la protéine au niveau du Groupement amino de la chaine latérale d’une Lysine. - Une deuxième enzyme (E2) se couple à la première et forme une complexe. - La Troisième enzyme (E3) est la ligase à proprement parlé qui va induire la formation de liaison Amide. - Dès que l’enzyme reconnait son substrat, elle greffe l’ubiquitine et empile les Ubiquitines pour former les poly U.
- Pour induire un signal de dégradation spécifique, il existe deux méthodes : - On introduit plusieurs Protéines « Ubiquitine » qui vont se fixer à Plusieurs Lysines. - Induction d’un site / d’une conformation pour que le signal de dégradation soit mis en place. En effet, je peux avoir une protéine non reconnue par une U-ligase sur laquelle je vais induire cette capacité de reconnaissance. On peut effectuer ceci par : - Phosphorylation d’une protéine ionisable. - Démasquage par dissociation d’un complexe. - Création d’un N terminal déstabilisant qui va être fixé au C terminal de L’U.
H) Différente sortes d’ubiquitinylation pour des rôles différents de l’ubiquitine. - Mono-ubiquitinylation : Régulation de la fonction des Histones. - Multi- ubiquitinylation : Endocytose. - Poly ubiquitinylation : - Par marquage sur la Lysine 48 Dégradation du Protéasome - Par marquage de la Lysine 63 : Réparation de l’ADN.
I) Résistance aux protéases de certaines protéines de conformations anormales. - Certaines protéines anormales forment des agrégats non dégradables par les enzymes d’ubiquitinylation. C’est par ce système que sont créées les plaques amyloïdes observées dans la maladie d’Alzheimer. D’autres Pathologies sont également dues à ces agrégats : La Chorée d’Huntington… - Cette conformation anormale est capable de se transférer à des protéines voisines pourtant correctement formées initialement.
III – Le transport à partir du Cytosol. - Signaux de localisation nucléaire. - Signaux NLS qui exportent HORS du Noyaux (Riche en « K ») - Signaux NES qui importent dans la cellule (Riche en « L ») - Signaux d’importation dans les Mitochondries (Riche en (« R » et « K ») - Signaux d’import dans les chloroplastes dans les Peroxysomes & dans le RE - Signaux d’export Hors du RE.
A) Transport à travers les pores du noyau 1 – Introduction - 3 000 à 4000 pores par noyau soit 10 pores/µm3 - Importation de 106 molécules d’histone toutes les 3 minutes soit 100 pores/minute dans une cellule en phase S. - Transport jusqu’à 500 macromolécules dans un sens comme dans l’autre en 1 Minute. - Exportation de 6 ribosomes dans une cellule en croissance en 1 minute.
- Transports des ARNm ; ARNt ; snARN ; ARNr 5s et d’autres ARN et RNP (RiboNucléo-Protéines.) - Les Molécules peuvent diffuser si elles sont suffisamment petites avec un PM < 5000 (Voire 3 000 Da Grand MAX.) - Quelles sont les Différences de mécanismes entre exportation et importation sachant que TOUS les pores ont-un système d’entrée et de sortie des éléments ?
2 – Perforation de la double membrane par des pores nucléaire : Leur structure. - Grâce à la lamina, la chromatine s’accroche à la membrane nucléaire. - La perforation de la membrane est formée par des complexes protéiques important = Les Complexes du Pore. - Ce Complexe du Pore présente une structure fibrillaire vers l’extérieur et vers l’intérieur du noyau. La structure fibrillaire vers l’intérieur du noyau forme un panier qui ressemble à un panier de Basket. - Le complexe du pore nucléaire pèse 125 MDa. Il est constitué de Nucléoporines (Protéine globulaire qui forme un anneau autour du Pore) qui sont associées aux protéines des fibrilles. Ces Nucléoporines contiennent de nombreuses répétitions « F-G » qui jouent un rôle dans le transport actif des protéines vers l’extérieur ou vers l’intérieur du noyau. - Le diamètre des Complexes du Pore est d’environ 0,1 µm. 
2 - Transport par diffusion et transport actif dans le noyau à travers les pores. 2.1 - Démonstration du transport actif : Exemple du NLS. - Fixation de la protéine sur le noyau des cellules. Si on change un acide aminé dans la séquence de ma protéine, on voit que la protéine s’accumule dans le cytoplasme. - On peut visualiser le transport actif grâce au couplage de la protéine NLS à une sphère d’or colloïdal.
2.2 – Nécessité d’un récepteur pour les protéines à importées dans le noyau. - On un récepteur (Importine) qui va fixer le signal de localisation nucléaire et va ainsi tirer la protéine vers l’intérieur de la cellule.
 - On peut avoir également un intermédiaire entre le récepteur et la protéine à importer ce qui permet une plus grande diversité des molécules à importer.
 - Cependant, l’Importine est la plupart du temps fixée directement à la protéine à intégrer.
2.3 – Transport par la Protéine G couplée à la molécule de GTP. - On va devoir fournir d’énergie pour faire passer ces protéines de l’autre côté de la membrane. On utilisera donc les RAN-GTP/RAN-GDP qui vont apporter cette énergie et déterminer le sens du passage à travers la membrane.
2.3.1 – Trafic du Cytosol vers le Noyau
 - Dans le Cytosol la protéine se fixe à l’Importine, automatiquement le complexe va vers le noyau. - Dans le noyau le complexe rencontre une RAN-GTP qui se fixe sur l’Importine (grâce à une enzyme : RAN-GEF fixée à la chromatine) et va libérer la protéine à transporter. - Lorsque l’Importine ressort du noyau, elle va être hydrolysée par une RAN-GAP qui va enlever un groupement Phosphate au GTP (fixé à l’Importine dans le noyau). On obtient donc dans le Cytosol une Importine fixée au GDP prêt à recevoir une nouvelle protéine à transportée.
2.3.2 – Trafic du Noyau vers le Cytosol - On va chercher à faire sortir la protéine du noyau. - On utilise Non plus une Importine, mais une Exportine. - Le Principe est le même sauf que l’Exportine liée au GTP va FIXER la protéine (et non pas s’en débarrasser comme le fait l’Importine.) et l’Exportine liée au GDP va SE DEBARASSER de la Protéine (et non pas se lier avec comme le fait l’Importine.)
- L’Importine et l’Exportine sont des Karyopherines.
- Exemple de régulation par ce système : Transport de Naf-T qui est un FT qui active l’expression de gènes quand les lymphocytes doivent s’activer pour participer à la réponse immunitaire. - A l’état de base, le NAF-T est phosphorylé. Pour s’activer, on va avoir une entrée de calcium qui active la Calcinurie qui va enlever les groupements phosphates à ce FT ce qui va activer ce facteur de transcription qui va interagir avec les importines, rentrer dans le noyau et agir sur le noyau. - Pour revenir à l’état basal, on a un arrêt de production importante de Calcium. - Cyclosporine A et FK506 sont des inhibiteurs de la Calcinurie. Ce sont des agents qui sont prescrits après une greffe afin d’éviter son rejet par des lymphocytes.
B) Transport dans les Mitochondries - La Mitochondrie est la centrale énergétique de la cellule. - Le Glucose des aliments est dégradé en Pyruvate qui est amené à la mitochondrie, on va générer, au sein de la mitochondrie, un gradient de protons Création d’énergie par formation d’ATP. - Cycle de Krebs Energie / Thermogénèse (Production de Chaleur chez les animaux.) - Chez l’Homme, l’ADN mitochondrial est tout petit (16 Kb environ). Il est circulaire et ressemble beaucoup à une énorme bactérie. Chaque mitochondrie contient plusieurs copies de son ADN. -Il code pour 2 ARNr (12 S +16 S), 22 ARNt et 13 protéines qui serviront à son fonctionnement.
1 - Structure générale de la Mitochondrie et problème de transport. - On a « une graine qui contient des filaments. » - La mitochondrie est présente une membrane externe et une membrane interne qui est constituée de crêtes qui permettent d’augmenter la longueur de la membrane interne. C’est en effet au niveau de ces crêtes qu’on à la chaine respiratoire. - On peut distinguer un compartiment intra-membranaire et la matrice mitochondriale. - Le transport des électrons active des pompes qui créent un gradient de protons de part d’autre de la membrane interne. Une fois ce gradient de proton créé, on une réincorporation des protons dans la matrice via une pompe : ATP synthase qui, par le passage des protons, va produire des molécules d’ATP.
- Pour que ce passage de Protons dans l’ATP Synthase soit efficace, il faut que la membrane interne soit imperméable aux protons et aux électrons. Il y a donc une divergence des caractéristiques entre les 2 membranes de la mitochondrie puisque la membrane externe est-elle perméable aux protons.
- Les électrons proviennent principalement des aliments. Ils servent à la formation d’un gradient de protons qui permet : - La formation d’ATP (Création d’énergie.) - Le Déplacement des cellules par les flagelles (chez la bactérie.) - Le Transport actif à travers les membranes de la mitochondrie. - Les Molécules qui participent au cycle de Krebs sont le Pyruvate & les Acides gras dans la mitochondrie. - A partir de ce Pyruvate et de ces acides gras, on va former de l’Acétyl-CoA. On va avoir une étape intermédiaire (β-oxydation) pour les acides gras. - Cet Acétyl-CoA va rentrer dans le Cycle de Krebs. Un Transport d’électrons par des cofacteurs (NADP) va créer un gradient de charges (par les électrons et le protons disposés de parts et d’autre de la membrane interne.) - Dans des cas de carences sévères (malnutrition, famine…) la mitochondrie peut réquisitionner des acides aminés qui vont être puisés dans les muscles (squelettiques notamment.) Ce phénomène explique la fonte musculaire dans les périodes de famine. - Au contraire, dans des conditions d’excès alimentaire, on va avoir un excès de Citrate (Produit du Cycle de Krebs) qui va participer au stockage des acides gras. On fait du gras !
2 – Moyens d’étude la mitochondrie. - Pour passer du Cytosol à la Mitochondrie, on a un passage des molécules par des passages hydrophobes. - Techniques d’observation & d’Analyse : -On casse au préalable de la membrane externe en mettant la Mitochondrie dans une solution Hypotonique. On effectue par la suite une centrifugation différentielle. - En utilisant le ME, on peut reconstruire des images 3D : On fait plein d’images en tournant notre mitochondrie dans l’espace. Par des calculs mathématiques poussés, on créer une image 3D : le Tomogramme. - Les Microtubules sont liés à la Mitochondrie car les MT permettent le déplacement des organites au sein de la cellule. - Les Mitochondrie ont des formes différentes selon leur localisation.
3 – Génome de la mitochondrie, sa réplication et son expression - La réplication du génome bactérien se multiplie par forcément quand il y a division cellulaire ! - Protéine de la membrane externe qui régule la division des mitochondries (comme les bactéries.) - Les mitochondries sont des structures dynamiques qui peuvent s’auto-éliminer en partie, si des régions de la mitochondrie ne fonctionnent pas bien. Elles peuvent aussi se rassembler pour former des réseaux.
- Il n’y a pas d’introns dans l’ADN mitochondrial. Cet ADN mitochondrial est transcrit en 2 ARN qui sont la transcription de la totalité du génome mitochondriale (càd que l’ARN code tout l’ADN) sur les DEUX brins. - La Production des 2 ADN pré-messagers qui vont être coupé en unités fonctionnelles qui vont coder les protéines fonctionnelles. 90% de l’ADN transcrit n’est pas codant et donc va être dégradé suite à cette transcription. - La partie des protéines synthétisées par la mitochondrie est très faible (1%). La plupart des protéines (99 % restants) agissant dans la mitochondrie sont formées par l’ADN génomique.
Comment démontrer le transport des protéines du cytosol dans la mitochondrie ? -On effectue un mini-expérience en mettant en solution aqueuse des protéines. On rajoute à ce mélange des mitochondries et on fait (quelques instants après) une hydrolyse par la trypsine qui va détruire les protéines qui ne seront pas rentrées dans les mitochondries.
5 – Translocation dans la matrice de la mitochondrie 5.1 – Intégration des protéines extra-mitochondriales dans la mitochondries. - Les Mitochondries présentent des sites où les membranes externe et interne sont en quasi contact : C’est à ce niveau que vont se faire les échanges de protéines entre le milieu extra-mitochondriale et la mitochondrie ! - De manière générale, lorsqu’une protéine veut rentrer dans un organite, elle doit être dotée d’un peptide signal (du côté N terminale de la protéine) qui va être hydrolysé une fois la protéine entrée. - Il faut également que la membrane externe de la Mitochondrie soit pourvue de récepteurs qui vont reconnaître le peptide signal de la protéine à intégrer dans la mitochondrie. - Les canaux de translocation permettent de faire passer des protéines sans que celle-ci ne soit en contact avec la membrane (Ceci permet l’intégration de protéines hydrophiles.) - Certaines protéines qui veulent rentrer dans la mitochondrie (comme l’alcool déshydrogénase) présentent des hélices α amphiphiles.
5.2 – Intégration des futurs récepteurs de la membrane externe de la Mitochondrie - On a des porines (récepteur membranaires qui est formé à |