Synthèse in vitro








télécharger 151.69 Kb.
titreSynthèse in vitro
page5/6
date de publication02.04.2017
taille151.69 Kb.
typeThèse
p.21-bal.com > loi > Thèse
1   2   3   4   5   6

I.1.14.RT-PCR



La RT-PCR se déroule en deux phases. Une première phase correspond à la copie d’ARN messager en ADN complémentaire (ADNc) et une seconde phase correspond à une réaction PCR classique sur le ADNc synthétisé.

Dans la première phase, l’ARN messager à étudier est répéré en utilisant une sonde oligonucléotidique spécifique (amorce 1 qui s’hybride à l’extrémité 3’ du seul mARN auquel on s’intéresse), puis la transcriptase inverse (ou rétrotranscriptase) permet la synthèse du brin complémentaire (sous une forme de ADNc simple brin), une seconde amorce oligonucléotidique spécifique (amorce 2) permettra la synthèse du second brin par extension.

L’ADN complémentaire synthétisé servira ensuite de matrice pour une réaction PCR classique.

La technique RT-PCR a permis de montrer que la transcription de tous les gènes s’effectuait dans tous les tissus et ceci même pour les gènes qui présentent une très grande spécificité tissulaire. On parle dans ces conditions de transcription illégitime. Il est évident qu’avant les techniques d’amplification génique, la sensibilité des méthodes classiques n’avait pas permis de mettre en évidence un tel phénomène.


I.1.15.Clonage


Un clone correspond à un grand nombre de molécules ou de cellules identiques provenant d’un seul ancêtre (cellule ou molécule). L’opération qui consiste à obtenir ce grand nombre de cellules ou de molécules s’appelle le clonage.
Le clonage nucléique consiste en l'insertion d'un fragment d'ADN dans un vecteur, ce vecteur étant propagé dans une cellule hôte. La culture de cette cellule et la purification ultérieure du vecteur permettent de produire des quantités quasiment illimitées du fragment d'ADN cloné que l'on désire étudier.

ADN recombinant


Il s’agit d’un ADN hybride obtenu au laboratoire par la combinaison de deux ADN appartenant à deux espèces différentes.

Les banques de clones



La construction d'une banque de clones est une étape préalable nécessaire à la cartographie physique. L'étude d'un génome débute toujours par le découpage de l'ADN (digestion par des enzymes de restriction) en fragments qui sont insérés dans des constructions moléculaires appelées vecteurs de clonage. Ces derniers sont ensuite intégrés dans des cellules qui assureront le maintien et la réplication du fragment d'ADN. Un ensemble de cellules portant des fragments d'ADN de l'espèce étudiée constitue une banque de clones (un fragment par clone).

L'objectif de la banque est donc de conserver une collection de fragments d’ADN :

  • bien identifiés,

  • facilement manipulables,

  • que l'on peut produire en grande quantité (en vue de leur étude).

On pourra notamment alors procéder au séquençage de chacun de ces fragments.


Les vecteurs de clonage: plasmides ; cosmides ; BAC ; PAC ; YAC

Généralites

On appelle vecteur l’ADN dans lequel on insère le fragment d’ADN à étudier. L’ADN inséré est appelé insert ou ADN étranger ou ADN exogène. Cette séquence nucléotidique est capable de s’auto-répliquer.

Les vecteurs sont donc des petits ADN dans lesquels on insère un fragment d’ADN que l’on veut étudier. Ces petits ADN sont généralement des plasmides ou des bactériophages. Il est nécessaire d’introduire ces bactériophages ou plasmides dans les bactéries pour réaliser une multiplication de ceux-ci.
Les plasmides

Les plasmides sont des petits fragments d’ADN circulaire présents dans la cellule bactérienne et indépendants du génome bactérien.
Propriétés générales des plasmides

Les plasmides présentent les caractéristiques suivantes:

- Leur ADN est bicaténaire, circulaire avec un nombre de nucléotides inférieur à 10 kb (1 kilobase = kb = 1000 nucléotides).

- Le nombre de plasmides dans une cellule bactérienne peut être considérable (plusieurs centaines).

- Les plasmides portent normalement des gènes qui leur confèrent un avantage sélectif, par exemple une résistance à un antibiotique.

- Leur réplication est indépendante de celle du génome bactérien.

Préparation des plasmides

Les bactéries contenant les plasmides sont mises en culture dans un grand volume (jusqu’à 2 litres de milieu de culture). Quand la concentration bactérienne atteint une valeur suffisante, on traite par un antibiotique (comme le chloramphénicol) qui empêche la croissance bactérienne sans affecter la réplication des plasmides. On récupère les bactéries par centrifugation. Puis, on perméabilise la paroi bactérienne par un traitement doux permettant d’obtenir un passage en solution des plasmides qui sont plus légers que l’ADN bactérien. La purification des plasmides peut être ensuite réalisée par chromatographie liquide à haute performance ou ultra-centrifugation en gradient de densité.
Préparation des plasmides pour la recombinaison, constitution de l’hybride et transformation bactérienne.

L’insertion d’une séquence d’ADN bicaténaire dans un plasmide nécessite un traitement préalable par une enzyme de restriction. On choisit une enzyme qui a un site unique dans la séquence plasmidique. Après action de l’enzyme de restriction, le plasmide circulaire est linéarisé. Pour maintenir la linéarisation, il est indispensable de traiter le plasmide linéaire par une phosphatase alcaline qui enlève les groupements phosphates en 5’. Le plasmide linéarisé et traité par une phosphatase alcaline est ajouté au fragment d’ADN à insérer en présence d’une ligase. L’ensemble de ces étapes produit un plasmide recombinant.

Les bactéries peuvent être placées dans certaines conditions physico-chimiques pour permettre aux plasmides d’être incorporés à l’intérieur de celles-ci. Les bactéries traitées et prêtes à recevoir l’ADN étranger sont appelées bactéries compétentes. L’incorporation des plasmides dans les bactéries est appelée transformation bactérienne.



Sélection des bactéries transformées par des plasmides

Le taux de transformation des bactéries est généralement très faible. Il est fondamental de disposer de méthodes permettant d’obtenir des bactéries transformées par les plasmides et seulement celles-ci. Pour cela, l’artifice consiste à utiliser une résistance à un antibiotique (par exemple: l’ampicilline). La transformation d’une bactérie sensible à un antibiotique par des plasmides portant un gène de résistance au même antibiotique aboutit à l’apparition d’une résistance uniquement pour les bactéries ayant incorporé les plasmides.

Cette technique permet de séparer les bactéries comportant des plasmides et les bactéries sans plasmides car ces dernières sont tuées. Cependant, elle ne permet pas de distinguer les bactéries avec plasmides intacts des bactéries avec plasmides recombinants. On utilise pour cela une résistance à un second antibiotique, par exemple: une tétracycline. L’insertion du fragment d’ADN dans le plasmide doit inactiver le gène de résistance au deuxième antibiotique. Les bactéries transformées par les plasmides recombinants sont donc résistantes au premier antibiotique (ampicilline) et sensibles au deuxième antibiotique (tétracycline). Les bactéries non transformées sont sensibles aux deux antibiotiques.


Un exemple de plasmide: le puc19

Un plasmide classique est le pUC19. La séquence complète est connue (2686 nucléotides). Il comporte les particularités suivantes:

- Un gène de résistance à l’ampicilline (antibiotique). La présence de ce gène permettra à la bactérie porteuse de ce plasmide de ne pas être sensible à l’effet de cet antibiotique.

- Le gène lac Z qui code pour la b-galactosidase dans l’opéron lactose.

- Enfin, une région avec des sites multiples et uniques pour des enzymes de restriction connues. Cette région est appelée " polylinker ". Son rôle est de permettre l’insertion du fragment d’ADN étranger.

Commentaires sur le plasmide pUC 19. Ce type de plasmide est intéressant car il montre un système de sélection des bactéries ayant été transformées par les plasmides recombinants. Un système enzymatique appartenant à l’opéron lactose peut être utilisé à la place d’un second antibiotique. L’insertion du fragment d’ADN dans le plasmide pUC 19 aboutit à l’inactivation du gène qui code pour la b-galactosidase. Pour vérifier la présence ou l’absence de l’activité enzymatique b-galactosidase, on utilise un galactoside dont la couleur passe de l’incolore au bleu quand il est clivé par la b-galactosidase, ce composé s’appelle X-gal. Pour pouvoir métaboliser le X-gal, la cellule doit être exposée à un inducteur, cet inducteur est le IPTG (isopropylthio-b-D-galactoside).

En culture et en présence d’IPTG et de X-gal, les bactéries résistantes à l’ampicilline et transformées par les plasmides recombinants se présentent sous forme de colonies blanchâtres car elles ont perdu la capacité de clivage de l’équivalent coloré du lactose (le X-gal) par la b-galactosidase. Par contre, les bactéries résistantes à l’ampicilline et non transformées par les plasmides recombinants se présentent sous forme de colonies bleues. La sélection visuelle des bactéries transformées par les plasmides recombinants est donc possible.

Avantages et désavantages des plasmides

Avantages:

- Petite taille du vecteur, permettant un travail expérimental aisé.

- Sélection des plasmides recombinants (sélection par les antibiotiques).

Désavantages:

- Faible efficacité pour la transformation des bactéries (pénétration de plasmides).

- Impossibilité d’insérer des larges fragments d’ADN.



Les phages


Propriétés générales des phages

Les phages sont des virus qui infectent les bactéries. Deux phages sont très utilisés comme vecteurs: le phage lamba et le phage M13 (mais maintenant les phages dérivés de ces deux phages). Les séquences de ces phages utilisés comme vecteurs sont connues (40 à 50 kb d’ADN double brin). Les extrémités de cet ADN sont simples brins sur une longueur réduite, et complémentaires l’une de l’autre et surtout formant des extrémités cohésives. Ces séquences sont appelées séquences cos (pour cohésives).

Deux parties sont individualisées dans le phage lamba:

- La tête du virus: elle renferme l’ADN viral.

- La queue du virus: elle renferme des protéines. Elle permet la fixation du virus sur la cellule-hôte bactérienne.

Le virus lamba se multiplie selon deux modes possibles: soit par multiplication lytique, soit par multiplication lysogénique.

- La multiplication lytique.

Le virus s’adsorbe spécifiquement à la surface des bactéries. Il injecte son ADN à la cellule-hôte. L’ADN viral se circularise dans la bactérie. Puis, une phase complexe de réplication débute et aboutit à la constitution de nombreuses particules virales à l’intérieur du cytoplasme bactérien. La lyse bactérienne provoque la libération des particules virales.

- La multiplication lysogénique.

Comme dans la multiplication lytique, le virus s’adsorbe et pénètre dans la bactérie. L’ADN viral s’intègre à l’ADN bactérien et sera répliqué en même que lui.

Le génome du phage lambda peut être divisé en:

- Parties essentielles comprenant:

- les gènes codant pour les protéines situées dans la tête et les protéines situées dans la queue du virus.

- Les sites cos.

- Le site de réplication de l’ADN viral.

- Parties non essentielles:

- Ce sont les gènes impliqués dans la lysogénie.

Un exemple de vecteur de cette catégorie est le phage lambbda-GEM®-11 proposé par la société de biotechnologie Promega. Ce phage accepte des fragments d’ADN de 9 kb à 23 kb. Il possède des promoteurs pour la T7 ARN polymérase et la SP6 ARN polymérase. Ces promoteurs d’ARN polymérases permettent la synthèse de sondes ARN à partir d’une extrémité du fragment cloné. La T7 ARN polymérase est extraite des colibacilles (E. coli) infectés par le phage T7. La SP6 ARN polymérase est extraite d’une souche de Salmonella typhimurium.

Sur le bras gauche (20 kb), on retrouve successivement dans le sens 5’à 3’, un site pour l’enzyme Sfi I, puis le promoteur T7, suivi par des sites de restriction uniques (Sac I, Xho I, Bam HI, Avr II, Eco RI et Xba I). Sur le bras droit (9 kb), on retrouve dans le sens 5’à 3’, des sites de restriction uniques pour Xba I, Eco RI, Avr II, Bam HI, Xho I et Sac I, suivis par le promoteur SP6 et enfin un site Sfi I. Il est important de noter l’orientation des promoteurs des ARN polymérases T7 et SP6 pour la synthèse des ARN messagers correspondants.

Notes complémentaires pour comprendre le fonctionnement des ARN polymérases:

Les ARN polymérases copient l’ADN double brin en ARN. Elles possèdent les propriétés suivantes:

- Elles n’ont pas besoin d’amorce pour commencer la synthèse de l’ARN.

- Elles ont besoin bien entendu des quatre nucléosides triphosphates (NTPs; N = A, G, U et C) et de Mg2+.

- Elles n’ont pas de fonction d’édition.

- Elles doivent impérativement reconnaître un promoteur spécifique.

- Comme toutes les polymérases, elles synthétisent le nouveau brin dans le sens 5’à 3’.
Avantages et désavantages des phages

Avantages:

La taille des fragments d’ADN insérables est supérieure à celle des plasmides (40-50 kb).

La transformation des bactéries (=incorporation des phages) est plus efficace que pour les plasmides.

Désavantages:

Nombre de sites de restriction restreints dans le génome des phages.

Obligation d’empaqueter l’ADN.

Contraintes de taille pour l’ADN à insérer.

Les cosmides
Propriétés générales des cosmides

Les cosmides sont des vecteurs artificiels hybrides: phage lambda-plasmides. En fait, ils se comportent comme des plasmides avec des sites de restriction permettant l’insertion d’ADN étranger. Ils renferment également un gène de résistance aux antibiotiques (ampicilline). De plus, un site cos d’un virus lambda a été inclus dans leur ADN circulaire ce qui permettra au cosmide d’être empaqueté dans la tête d’un virus lambda.

Avantages et désavantages des cosmides

Avantages:

La taille des fragments insérables peut atteindre 50 kb.

Leur incorporation dans les bactéries (transformation) est plus efficace que pour les plasmides.

Désavantages:

Obligation d’empaqueter l’ADN.

Autres types de vecteurs

D’autres vecteurs existen tavec possibilité de cloner des fragments d’ADN de taille élevée (au moins jusqu’à 500 kb)

Les BAC

(Bacterial Artificial Chromosome)

Peuvent cloner des fragments d'ADN de taille variant de 100 à 200kb.
Les PAC

(P1-derived Artificial Chromosome)

Peuvent cloner des fragments d'ADN de taille variant de 100 à 200kb.
Les YAC

(Yeast Artificial Chromosome : Chromosome artificiel de levure).

Peuvent intégrer des fragments de grande taille (jusqu'à 400kb). Indispensables pour analyser les grands génomes (notamment, le génome humain). A noter : pour obtenir de grands fragments d'ADN, on utilise des enzymes de restriction qui ne coupent que très rarement.

Inconvénient : les fragments insérés subissent parfois des réarrangements (insertions, chimérismes, délétions) : les YAC ne peuvent être considérés comme absolument représentatifs de la région initiale introduite.



        1. Les vecteurs d’expression et les cellules hôtes


D'une façon synthétique, l’expression d’un ADN recombinant s'appuie sur la succession d'opérations suivantes, chacune générant ses propres difficultés :

  • tout d'abord, il s'agit d'isoler un gène d'intérêt, codant pour une protéine dont la synthèse artificielle en quantité est nécessaire : (médicament, additif, …);

  • le gène d'intérêt est alors inséré dans un vecteur (en général un plasmide), qui doit être capable de se répliquer et de répliquer le gène étranger qui lui est rattaché ;

  • la molécule d'ADN recombinant obtenue (vecteur + gène d'intérêt) est ensuite introduite dans une cellule hôte, qui exécute les instructions qui lui sont fournies par le gène d'intérêt, et réalise les modifications post-traductionnelles dans l'objectif de fabriquer la protéine recherchée. L'hôte peut être une bactérie (E. coli), une levure, une cellule de mammifère ou encore une plante ou un animal transgéniques ;

  • il s'agit alors de passer par une phase de production, généralement en fermenteur (en ce qui concerne les micro-organismes et cellules de mammifères), afin de produire les volumes de protéine nécessaires ;

  • la protéine doit enfin être récupérée puis purifiée, cette étape faisant appel à des techniques plus classiques (séparation, extraction, purification) mais pouvant se révéler longue et onéreuse ;

  • il s'ensuit des essais biochimiques et immunologiques (contrôle qualité) permettant de contrôler la pureté de la protéine obtenue, son activité, etc.

Les protéines recombinantes sont ainsi qualifiées dans la mesure où elles sont produites par des cellules dont l'ADN a été modifié par recombinaison génétique.

Au sens large, un système de production adapté à la fabrication d'une protéine recombinante donnée, est un process biotechnologique qui s'appuie principalement sur :

  • l'emploi d'un vecteur d'expression (en général un plasmide ou un virus -pour les vecteurs eucaryotes-), jouant le rôle de transporteur génétique du gène d'intérêt codant pour la protéine recherchée ;

  • l'utilisation d'une cellule hôte, chargée d'exécuter les instructions fournies par le gène d'intérêt qui lui est inséré, dans l'objectif de synthétiser la protéine recherchée ;

  • une phase de production proprement dite permettant de fabriquer les volumes de protéines souhaités ;

  • enfin, une séparation et extraction de la protéine du milieu de culture, suivie par une purification de celle-ci.

Au sens restreint, un système de production de protéines recombinantes est caractérisé par un couple constitué d'un vecteur d'expression et d'un hôte (cellule ou organisme).

Une vaste gamme de systèmes de production de protéines recombinantes -c'est-à-dire, au sens restreint, de couples vecteurs-hôtes- est aujourd'hui disponible, chacun d'eux présentant des avantages et des inconvénients. Les hôtes les plus utilisés à l'heure actuelle sont incontestablement la bactérie Escherichia coli, la levure Saccharomyces cerevisiae et les cellules CHO extraites des ovaires de hamster.

1   2   3   4   5   6

similaire:

Synthèse in vitro iconLa viande in vitro bientôt dans notre assiette ? Avec Hanni Rützler,...

Synthèse in vitro iconRésumé. Après un rappel des effets biologiques bénéfiques reconnus...
«subtils» qui peuvent apparaître pour des densités de puissance bien inférieures à celles relatives aux effets “thermiques”

Synthèse in vitro iconSynthèse lors de la 6

Synthèse in vitro iconEssai de synthèse

Synthèse in vitro iconSynthèse Personnelle

Synthèse in vitro iconSynthèse de stage

Synthèse in vitro iconSynthèse additive

Synthèse in vitro iconF iche de synthèse : rei

Synthèse in vitro iconSynthèse de vos apprentissages 23

Synthèse in vitro iconSynthèse de la Doctrine exposée 96








Tous droits réservés. Copyright © 2016
contacts
p.21-bal.com