Méthode de Kjeldahl








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La partie suivante a été rédigée à partir d’un protocole élaboré par Chantal Racine et Éric Athlan du Éléments de biochimie

210-120-AH (hiver 2012)

Laboratoire 3a1

Analyse quantitative des protéines
Buts :

  • Effectuer un dosage colorimétrique des protéines par la méthode du Biuret.

  • Déterminer la concentration en protéines d’une solution inconnue.


Théorie :
Mulden, au début des années 1800 fut le premier à qualifier de « protéines » certaines substances azotées complexes telles la gélatine, la caséine, la fibrine, qu’il pouvait isoler du matériel vivant. Puis en 1820, Braconnot démontra pour la première fois la présence d’un acide aminé, la glycine, par hydrolyse acide de la gélatine. Depuis ce temps, plusieurs méthodes ont été développées pour doser directement ou indirectement les protéines. En voici un résumé.

Méthode de Kjeldahl


La composition élémentaire des protéines montre toujours la même répartition entre les éléments suivants :


Élément

%

C

50-55

H

6-7

O

20-23

N

14-17


L’azote est l’élément le plus caractéristique chez les protéines de sorte que le contenu azoté d’un tissu (animal ou végétal) ou d’un aliment est souvent utilisé comme mesure du contenu en protéines de ce tissu ou de ce produit.
Comme le contenu en azote des protéines est d’environ 16 %, la quantité de protéines d’un échantillon est obtenue en multipliant par 6,25 (100/16) la valeur de la quantité d’azote. De plus, on connaît pour des catégories de tissus ou aliments des références plus précises sur le pourcentage. Il est évident que l’utilisation de ce facteur ne vaut que si le matériel est exempt de substances azotées de nature non protéique.
Le dosage de l’azote par la méthode de Kjeldahl a l’avantage d’être simple, de requérir des produits chimiques et des appareillages plutôt communs et d’être applicable à la plupart des composés organiques azotés, hydrosolubles ou non. Cette méthode est encore utilisée de nos jours, elle est très utile pour analyser de grands nombres d’échantillons lorsque des valeurs approximatives sont suffisantes.
La substance protéique est mise à digérer (oxydation) dans H2SO4 concentré bouillant en présence d’un catalyseur (CuSO4, SeO2) et de Na2SO4 solide qui, en haussant la température d’ébullition du mélange (par ébullioscopie, propriété colligative), permet une meilleure dégradation. Les éléments autres que N (C, H, O, S) sont transformés en leur oxyde (CO2, H2O, SO2) alors que l’azote conserve dans ces conditions sa forme aminée (NH4+).

Le milieu acide est ensuite rendu alcalin dans un appareil à distillation afin de recueillir l’azote sous la forme de vapeur d’ammoniac (NH3), laquelle est ensuite dirigée dans une solution acide (en excès) de titre connu. En titrant l’acide n’ayant pas réagi avec NH3, on calcule par différence la quantité de NH3 ayant réagi, et par le fait même, la quantité d’azote dans le matériel de départ.

Absorption dans l’ultra-violet

Les résidus d’acides aminés aromatiques absorbent aux environs de 280 nm. On peut donc se servir de ces résidus pour doser des protéines à condition qu’il n’y ait aucune autre substance absorbant dans le voisinage.

Or les acides nucléiques accompagnent souvent les protéines et peuvent causer de l’interférence. La méthode est très rapide et sensible mais il faut savoir que les protéines diffèrent par leur degré d’absorption dans l’ultra-violet (car la composition en acides aminés diffère).

Méthode de Folin


L’oxydation des acides aminés aromatiques (TYR et TRP) ou des protéines qui les contiennent par l’acide phosphomolybdotungstique donne une coloration bleue dont le maximum d’absorption est aux environs de 640 nm. Très grande sensibilité.

Méthode du biuret


Le biuret, formé à partir de l’urée et dont la structure est donnée ci-dessous, réagit avec les sels cuivriques en milieu alcalin pour donner une coloration bleu-violacée avec un maximum d’absorption à 540-560 nm. La partie de la molécule responsable du développement de la couleur est le lien dipeptide particulier H2N-CO-NH-CO-NH2.

Il a été découvert par la suite que tout peptide ou polypeptide contenant au moins 2 liens peptidiques (donc des tripeptides et des peptides supérieurs) réagit de façon semblable avec le réactif cuivrique, dans les mêmes conditions, pour donner la coloration caractéristique. On appelle donc réactif du Biuret un mélange de CuSO4, de sel de tartrate de KI et de NaOH. Les ions NH4+ peuvent causer une interférence. Cet essai permet donc de détecter la présence de protéines dans des solutions et même d’en mesurer quantitativement la teneur. Le complexe coloré qui se formerait aurait la constitution suivante :




Méthode de Lowry


Il s’agit essentiellement d’effectuer un Biuret, puis de transformer les résidus TYR et TRP par le réactif de Folin (voir plus haut). Le maximum d’absorption se situe à 750 nm. L’avantage découle de sa sensibilité : 100 fois plus sensible que le Biuret, la méthode ne requière que 5 à 10 g de protéines.

Préparation du cahier de laboratoire


Préparer un tableau pour noter les valeurs d’absorbance mesurée et prévoir de l’espace pour le graphique.

Traitement des données et production du rapport





  1. Les éléments habituels.

  2. Tracez la courbe standard de la protéine en exprimant l’absorbance en fonction de la concentration; inclure toutes les informations pertinentes à la reproduction de l’expérience. À l’aide du logiciel MS Excel, tracez la droite de régression linéaire et affichez l’équation ainsi que la valeur du coefficient de corrélation (R2) sur le graphique. La valeur du coefficient doit dépasser 0,99. Assurez-vous que le coefficient de corrélation soit le plus élevé possible, au besoin, retirez certains points.

  3. Calculez la concentration de la solution inconnue.

  4. Rédigez le rapport à l’ordinateur et expédiez une copie de la version électronique par courriel au plus tard une semaine après le déroulement de l’expérience.

  5. ATTENTION : VOUS DEVEZ REMETTRE UNE COPIE PAPIER




Matériel supplémentaire





  • Pipettes graduées 2 mL (4)

  • Pipettes graduées 5 mL (1)

  • Ballon 10 mL (1)

  • Vortex

  • Pipette volumétrique de 1 mL (1)

  • Spectronic 20 avec éprouvettes




Solutions


  • Solution de Biuret (ATTENTION! Solution corrosive)

  • Solution étalon BSA (Albumine de bovin 10 mg/ mL

  • Solution inconnue de protéine

Manipulations





  1. Préparer une dilution (1 :10) de sa solution inconnue de protéine, conserver l’échantillon pour la suite de l’expérience.

  2. Introduire dans des éprouvettes les quantités des réactifs indiqués dans le tableau suivant. L’addition doit suivre une progression horizontale de gauche à droite et s’accompagner toujours d’une agitation complète avec un appareil vortex. Pour l’inconnu non dilué, utilisez des volumes relativement petits et l’inverse pour l’inconnu dilué.




Protéine standard

Protéine inconnue

Tube :

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

Sol std BSA
10 mg/mL (mL)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

1,0

0

0

0

0

0

0

Sol. Prot. Inconnu non diluée (mL)

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0



















Sol. Prot. Inconnue diluée (mL)

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0



















H2O (mL)

1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0



















Biuret (mL)

4,0

4,0

4,0

4,0

4,0

4,0

4,0

4,0

4,0

4,0

4,0

4,0

4,0

4,0

4,0

4,0

Volume total (mL)

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

Utilisez davantage de tubes pour l’inconnu au besoin


  1. Laisser développer la couleur à la température de la pièce durant 30 minutes.

  2. Lire et noter l’absorbance à 540 nm.

  3. Transférer dans des petits flaconnets (Vial) la solution standrad de BSA et l’inconnu diluée.

  4. Conserver au réfrigérateur pour l’expérience 3b la solution standard BSA, la solution inconnue non diluée et la solution inconnue diluée.




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