Biologie et physiologie du développement végétal








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1.2La plante : un système intégré en interaction avec son environnement

1.2.1Contraintes de la vie fixée : adaptations développementales et plasticité du végétal


(p 8-9)

  • Perception de la lumière (photorécepteurs)

  • Perception de l’environnement chimique

    • Racines perçoivent des minéraux. ex : nitrate , CO2

  • Perception physique

    • T°C, vent, force de gravité

Plusieurs expériences : p 5, p12

1.2.2Tropismes

1.2.3Systèmes de perception des signaux

1.2.4Les hormones : nature, métabolisme et effets multifactoriels




2Modèle d’études en bio du dvpt des plantes

2.1Plantes modèles

2.1.1Antirinium (gueule de loup)


Possède deux atouts :

- mode de dvpt de la fleur particulier avec une fleur sans symétrie radiale mais latérale, pétales soudés.

- Existe sous forme de mutant : soit mutant de couleur ou de forme  étude des gènes de bio$ du dvpt
- donc abs de pigments, existence de mutants à sym radiale  gènes mutés

- comment identifier les gènes resp du dvpt ? Existence d’un transposon… lorsque fleur était au stade à 2 cell, une cell mutante s’est libérée de la présence du transposon  réversion génétique

- si on connait la sq moléculaire du transposon, il suffit de digérer l’ADN du mutant et de récupérer le locus contenant le transposon.
Autres modèles :

Zea Mais (mais sauvage est brun ou violet donc nous mangeons des mais mutants)

Oriza sativa

Medicago sativa ou troncacula (luserne) étude mutant de fixation de l’azote …symbiose

2.1.2Arabidopsis thaliana


- étude du dvpt de la plante

- plante de la famille des Crucifères (choux)

- aisance de génération de mutants ponctuels en imbibant graine dans sub mutagènes ou en irradiant les graines avec des rayons gama

- génome de l’espèce simple, non redondant donc proba d’identifier les mutants augmente

- toutefois 60% des gènes présents à l’état dupliqué

- génération de 2 mois (2-4 générations à l’année)

- croisement possible en pollinisant une plante émasculée

- petite taille (1m²= 50 plantes)

2.1.3Choix de l’espèce modèle


- dans l’idéal : généralisation à l’ensemble des plantes

ex : sauvage et mutant incapable de $ ho de croissance de arabidopsis et riz  mutation du gène de croissance

2.2Mutagenèse



2 façons employée par les généticiens :

  • Mutagenèse insertionnelle (transposon)

  • Utilisation de Agrobacterium

2.2.1Génération de mutant par l’insertion d’un gène dans un génome = mutagenèse insertionnelle



Mutants générés par la plante naturellement par mobilisation de transposons (= sq d’ADN mobile qui peut s’insérer au hasard sur un K de son hôte)
Deux manières d’agir pour le transposon :

- transposons s’insère dans le cadre ouvert de lecture (succession de codons qui codent pour un peptide)  code génétique interrompu mais peptide transcrit

- transposons s’insère dans le gène au nv du promoteur d’un gène ou dans la partie non codante et amène signaux d’arrêt de la transcription  gènes n’est plus transcrit
Rmq :

- souvent mutation nulle (abs totale du produit du gène) ou mutation avec expression modérée du gène lorsque transposon est situé à proximité du gène qui est seulement perturbé

- normalement transposon endogène mais on peut prendre transposon d’une autre espèce
Petite histoire de prix nobel :

- 1950 Barbara Mc Intock travaillait sur la transmission des caractères anormaux chez le mais  mutation pas stable dans le temps, peuvent réapparaitre

Théorie : il existe dans le génome des gènes qui ne sont pas à un endroit (prix nobel)

- Identification de 2 éléments mobiles : activator (AC) autonome + dissociator (DS) non autonome ayant besoin d’une enzyme codée par AC

- AC et DS ensenble sont fonctionnels

- plus tard, intro dans d’autres plantes modèles  même comportement  mutation de gène
Exp de southern blot (séparation selon taille) : mutagénèse insertionnelle


- on voit sq qui indiquent qu’il y a de nombreux transposons dans le génome du mais donc difficile d’identifier celui responsable de la mutation

- transposon tjs présent chez les mutants et non chez les sauvages

- révélation avec une sonde du transposon qui s’est inséré dans gène muté

- récup gène  séquençage

- détection de transposons (Mu)
NB : Chez Arabidopsis on a utilisé transposon du mais

2.2.2Nouvelle stratégie de mutagenèse insertionnelle utilisant Agrobactérium



- Agrobacterium tumeraciens crée maladie appelé « la galle » du collet (entre tronc et racine) par un évènement de transgénèse

- cell de la tumeur primaire se div en abs d’ho de croissance (pas de métastase, car cell végétales ne migrent pas)

- due à l’insertion de gène codant pour des enzymes d’ho de bio$ végétales dans le génome des cell infectées

- croissance anarchique, localisée à l’endroit de l’infection

- but : transfert de gènes de bio$ d’aa utiles à la bactérie  nouvelle niche

- les gènes procaryotes transférés ne sont pas supposés fonctionner dans une plante (eucaryote) surtout que la bactérie elle-même ne sait pas les utiliser


Obtention de mutants par Agrobacterium = outil de transgénèse

- chez l’animal on peut injecter un gène dans tissu et ADN se retrouve dans cellule, noy et puis dans ADN  cellule animale modifiée génétiquement facile

- chez les végétaux, deux obstacles : paroi, vacuole au centre de la cellule qui prend 80% du volume cellulaire et pression hydrique  pas facile sans faire exploser la cellule
- Agrobacterium tumefaciens possède un plasmide géant TI (tumor inductible)

- plasmide possède :

- gènes de réplication du plasmide (rep)

- gène de virulence (vir)

- ADN Transféré (ADN T) contenant gène de l’opines (codent pour gène codant pour enz de bio$) et d’ho végétales

- si blessure dans cellule végétale, bac peut transférer gène ADN T (p 29)

- cellule vég $ indicateur de blessure perçut par bac du sol

- récepteurs codé par protéine virA et virG de la bac qui fixent mol

- vir G activation de la production de l’ADN simble brin par coupure produit par série d’évènement codé par gène de la région Vir

- ADN simple brin fixe VirD de façon cov + chapelet de protéines Vir E pour protection (ressemble à un virus)

- structure migre de la bac. à la plante par pont cytoplasmique via la protéine Vir B à l’endroit où il n’y a pas de paroi pectocellulosique

- complexe transféré de façon active au cyto de la cellule végétale

- pénétration dans le noy par pore nucléaire

- dans nucléoplasme, ADN T s’intègre dans le génome via probablement une coupure de l’ADN simple brin

2.2.2.1Résumé :


- ADN T d’origine bactérienne (portion d’ADN plasmidique transféré du plasmide bactérien vers l’ADN de la plante)

- transfert induit par molécule codante dont protéine G (opéron) qui active région Vir

- insertion de l’ADN T se fait quasiment au hasard du génome nucléaire végétal et ressemble à un méca de recombinaison illégitime

- qq nucléotides complémentaires mais pas tous

- les enzymes de recombinaison et de réparation de la plante intègrent le génome bactérien

2.2.2.2Utilisation de Agrobacterium :


- utilisation du plasmide désarmé (ne produisant pas la maladie) pour insérer gènes d’intérêt dans plante

- outil de mutagénèse insertionnelle  cellule mutée dans un gène  récup cellule mutée  cellule totipotente  plante mutée
- ADN T peut être transféré jusque dans les gamètes surtout femelles car Agrobacterium peut vivre dans fleur

- insertion de gènes de résistance à des herbicides et aux antibiotiques pour sélectionner les cellules ayant intégrées ADN T (c’est pour ça que les OGM possèdent une résistance aux antibiotiques)

- 1/1000 vont être transformés

- ADN T a une chance sur deux de tomber dans un gène

- aujourd’hui on peut trouver dans le commerce tous les mutants d’inactivation de gène

2.2.2.3Exemple : faire des plantes transgéniques de tabac :


plante mère  prélèvement de disques filiaires  incubation en présence de Agrobactérium  milieu de sélection des cellules transformées (GSV)  Micro-propagation de bourgeons (culture in vitro)  plantule  plante exprimant le gène d’intérêt



- chez arabidopsis on trempe directement les fleurs dans agrobactérium

2.2.2.4Insertions de gènes rapporteurs



Insertions de marqueurs de localisation cellulaire (gène dont l’expression va être facilement observable)
On fait une fusion transcriptionnelle en prenant le promoteur du gène d’intérêt inséré devant la séquence d’un gène de bactérie

- insertion dans le plasmide Ti

- gène GUS capable d’hydrolyser le glucuronide

- précurseur hydrolysable synthétique du glucuronide (X-gluc)
2.2.2.4.1Fusion transcriptionnelle


Fusion transcriptionnelle = indique la capacité de transcription d’une séquence d’ADN étudiée, on accouple physiquement un promoteur de gène à un gène rapporteur (ex : GUS), ce qui permet de colorer les territoires où le gène va s’exprimer en bleu.

Ex : suite à un stress on peut voir que des gènes luttant contre le stress s’exprimer grâce à l’introduction d’un promoteur et d’un gène rapporteur (coloration X-glu)

On trempe les plantes dans le substrat de βglucuronidase.

Permet l’identification du rôle d’un gène


2.2.2.4.2Fusion traductionnelle


Fusion traductionnelle = prélèvement de la totalité du gène et couplage de l’ensemble à une nouvelle séquence codante marqueur de la séquence du gène. Transcription et traduction vont ê observées en même temps.

On enlève le codon stop et on remplace la partie non codante par un gène de protéine fluorescente (GFP : Green Fluorescent Protein)

ex : on peut détecter la présence d’organismes vivants ( présence d’ATP) dans les piscines

2 infos : une info sur la traduction, la régulation et la localisation cytologique de la protéine en question

ATG

Fusion traductionnelle




Promoteur du gène d’intérêt

Stop


RB

LB

Partie non codante remplacée par séquence fluorescente GFP



Chez méduse :


2.2.2.5La mutagenèse à l’aveugle



= apport d’ADN exogène grâce à Agrobacterium
= Génération de mutants par traitements chimiques/physiques des génomes des plantes
Traitement mutagène sur grand nb d’individu (nb optimal : 105 -106) (cf p 28)

Chez Arabidopsis, traitement mutagène sur gamètes difficile alors on fait la mutagénèse sur les embryons.
1) Traitement chimique EMS (Ethyl méthane sulfonate ; méthyle les bases de l’ADN => création d’aberration dans le génome => erreur dans la réplication de l’ADN)

2) Rayons X et gama, neutrons rapides créent cassures dans l’ADN ou trous qui peuvent être mal réparer et créer des mutations.
Il existe 4 cellules utiles à la mutagenèse dans l’embryon d’Arabidopsis, donc 4 types de générations mutantes dvpt de la plante devenue chimère et constituée de cellules mutées et d’autres normales.
Il faut repérer les parties mutées de la plante  utilisation des graines : 1/16 de mutants dans la descendance.
Explication :

Le ¾ des graines proviennent de la partie de la plante qui n’a pas subi la mutagénèse.

¼ des graines sont issues d’une cellule de l’embryon mutée de manière récessive qui donne un phénotype mutant (homozygote mutant m/m) que dans ¼ des cas.

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