Docteur de l’université pierre et marie curie








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THESE DE DOCTORAT DE

L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE
Spécialité

Chimie Physique et Chimie Analytique
Présentée par

Mathieu Goutayer
Pour obtenir le grade de

DOCTEUR de l’UNIVERSITÉ PIERRE ET MARIE CURIE

Sujet de la thèse :

Nano-émulsions pour la vectorisation d’agents thérapeutiques ou diagnostiques ; étude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo
Soutenue le 11 décembre 2008

devant le jury composé de :
M Jérôme Bibette Directeur de thèse

M Jean-Pierre Benoît Rapporteur

M Bertrand Tavitian Rapporteur

Mme Valérie Cabuil Examinateur

M Rémi Meyrueix Examinateur

Mme Isabelle Texier Examinateur


Université Pierre & Marie Curie - Paris 6

Bureau d’accueil, inscription des doctorants et base de données

Esc G, 2ème étage

15 rue de l’école de médecine

75270-PARIS CEDEX 06

Tél. Secrétariat : 01 42 34 68 35

Fax : 01 42 34 68 40

Tél. pour les étudiants de A à EM : 01 42 34 69 54

Tél. pour les étudiants de EN à ME : 01 42 34 68 41

Tél. pour les étudiants de MF à Z : 01 42 34 68 51

E-mail : scolarite.doctorat@upmc.fr











THESE DE DOCTORAT DE

L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE
Spécialité

Chimie Physique et Chimie Analytique
Présentée par

Mathieu Goutayer
Pour obtenir le grade de

DOCTEUR de l’UNIVERSITÉ PIERRE ET MARIE CURIE

Sujet de la thèse :

Nano-émulsions pour la vectorisation d’agents thérapeutiques ou diagnostiques ; étude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo
Soutenue le 11 décembre 2008

devant le jury composé de :
M Jérôme Bibette Directeur de thèse

M Jean-Pierre Benoît Rapporteur

M Bertrand Tavitian Rapporteur

Mme Valérie Cabuil Examinateur

M Rémi Meyrueix Examinateur

Mme Isabelle Texier Examinateur


Université Pierre & Marie Curie - Paris 6

Bureau d’accueil, inscription des doctorants et base de données

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Cette thèse a été préparée au sein du Laboratoire Colloïdes et des Matériaux Divisés (ESPCI) et du Laboratoire de Fonctionnalisation et Chimie des Microsystèmes (CEA Grenoble).

Laboratoire colloïdes et matériaux divisés
ESPCI-LCMD

10, rue Vauquelin

75005 Paris


Laboratoire de Fonctionnalisation et Chimie des Microsystèmes
CEA-Grenoble

LETI-DTBS-LFCM

17, rue des Martyrs

38054 Grenoble cedex
Nano-émulsions pour la vectorisation d’agents thérapeutiques ou diagnostiques ; étude de la biodistribution par imagerie de fluorescence in vivo
Résumé :
La nanomédecine représente le champ d’application des nanotechnologies, et plus particulièrement des nanoparticules, à la médecine. Ce nouveau domaine est très prometteur notamment en ce qui concerne la détection et le traitement de pathologies d’origine infectieuse, génétique ou cancéreuse. Nous avons développé de nouvelles nanoparticules biocompatibles et évalué leur potentiel en tant que nanocargos d’agents thérapeutiques ou diagnostiques grâce à l’imagerie de fluorescence in vivo. Ces particules sont des nano-émulsions de type huile dans eau, de quelques dizaines de nanomètres de diamètre, stabilisées par une couche de surfactants composée de phospholipides et d’agents de furtivité. L’encapsulation dans le cœur des nanoparticules de fluorophores organiques absorbant et émettant dans les longueurs d’onde compatibles avec les dispositifs d’imagerie de fluorescence permet de suivre leur biodistribution après injection dans des souris Nude. Ces nano-émulsions furtives et fluorescentes peuvent également être fonctionnalisées sur leur surface par des ligands de ciblage actifs tels que le peptide cRGD. De telles nano-émulsions fonctionnalisées montrent in vitro une adhésion spécifique avec les cellules exprimant l’intégrine αvβ3, un biomarqueur de l’angiogénèse. L’accumulation, passive et/ou active médiée par les cRGD, des particules au sein de différents modèles de tumeurs sous-cutanées implantés chez la souris Nude, est observée par imagerie de fluorescence non invasive.
Mots clés :
Nanoparticules ; Nano-émulsion ; Fluorescence ; Biodistribution ; Ciblage actif

Nanoemulsions for therapeutic or diagnostic agents vectorisation; biodistribution study by in vivo fluorescence imaging.
Abstract:
Nanomedecine represents the application field of nanotechnology, and more especially nanoparticles, to medicine. This new domain is promising in particular for the detection and treatment of infectious, genetic and cancer pathologies. We have developed new biocompatible nanoparticles, and evaluated their potential as nanocarriers for therapeutic or diagnostic agents thanks to in vivo fluorescence imaging. These particles are oil in water nanoemulsions, which diameter is less than an hundred nanometers, stabilized by a mixture of phospholipids and stealth agents. The encapsulation of organic dyes with absorbing and emitting wavelengths suitable for in vivo fluorescence imaging, allows the follow up of the nanoemulsions after their injection in mice models. Fluorescent stealth nanoemulsions can also be functionalized in order to covalently link onto their surface targeting ligands, such as the cRGD peptide. Indeed, cRGD functionalized nanoemulsions exhibit in vitro specific adhesion with cells expressing αvβ3 integrine, an angiogenic biomarker. The particle uptake, either passive and/or cRGD-mediated, in different tumor models bear by Nude mice, is observed using non invasive fluorescence imaging.
Key Words:
Nanoparticles; Nanoemulsion; Fluorescence; Biodistribution; Active targeting

Table des matières :


Introduction générale 15

Chapitre I :  
Nanoparticules pour le in vivo 19


I.1. Intérêt des nanoparticules pour la médecine 20

I.1.1. Définition des nanoparticules 20

I.1.2. Avantages des nanoparticules 21

I.1.3. Applications des nanoparticules 22

I.2. Les différentes nanoparticules 24

I.2.1. Différents types de nanoparticules 24

I.2.2. Les trois générations de nanoparticules 28

I.2.3. Nanoparticules, principe général 32

I.3. Exemples de nanoparticules pour le vivant utilisées en clinique 33

I.3.1. Nanoparticules à vocation thérapeutique 33

I.3.2. Nanoparticules à vocation diagnostique 34

I.4. Conclusion 35

Chapitre II :  
Imagerie médicale 37


II.1. Les différentes techniques d’imagerie 39

II.1.1. Imagerie moléculaire 40

II.1.2. Rayons X 41

II.1.3. Ultrasons 42

II.1.4. Imagerie par Résonance Magnétique 43

II.1.5. Imagerie nucléaire 44

II.1.6. Fluorescence 45

II.2. Imagerie de fluorescence 45

II.2.1. Principe et grandeurs physiques 45

II.2.2. Application de la fluorescence pour l’imagerie in vivo 48

II.2.3. Dispositifs expérimentaux 51

II.2.4. Traceurs 53

II.3. Conclusions 56

Chapitre III :  
Nouvelles formulations de nano-émulsions 59


III.1. Définition et propriétés des nano-émulsions 61

III.1.1. Les émulsions 61

III.1.2. Les nano-émulsions 63

III.2. Choix de la formulation 67

III.2.1. Détails des constituants 68

III.2.2. Choix de la technique d’émulsification 72

III.2.3. Protocole général de fabrication 75

III.3. Caractéristiques de la formulation de référence 76

III.3.1. Composition 76

III.3.2. Propriétés physiques 77

III.3.3. Stabilité et évolution dans le temps 85

III.4. Variations autour de la formulation dite de référence 88

III.4.1. Nature du cœur lipophile 88

III.4.2. Quantité totale de surfactants 91

III.4.3. Ratio phospholipides / surfactants pegylés 93

III.4.4. Longueur et structure des chaînes pegylées 96

III.5. Conclusions 99

Chapitre IV :  
Nano émulsions fluorescentes 103


IV.1. Localisation du fluorophore au sein des nanoparticules 105

IV.2. Choix des fluorophores 107

IV.2.1. Structure générale de fluorophores compatibles avec l’imagerie de fluorescence in vivo 107

IV.2.2. Cyanines 109

IV.3. Incorporation des fluorophores dans les nano-émulsions 112

IV.3.1. Production de nano-émulsions fluorescentes 112

IV.3.2. Calcul du nombre de fluorophores par globule 113

IV.3.3. Impact de l’encapsulation sur les propriétés des nano-émulsions 115

IV.4. Propriétés optiques des nano-émulsions fluorescentes 117

IV.4.1. Spectres d’absorption et d’émission 117

IV.4.2. Rendement quantique de fluorescence 123

IV.4.3. Durée de vie de fluorescence 127

IV.4.4. Vitesse de photoblanchiment 129

IV.5. Encapsulation et stabilité 131

IV.5.1. Stabilité de l’encapsulation 131

IV.5.2. Stabilité chimique du fluorophore 133

IV.6. Discussion et conclusions 138

IV.6.1. Discussion 138

IV.6.2. Conclusion 142

Chapitre V :  
Comportement des nano-émulsions en milieu biologique 145


V.1. Le sang, un véhicule de distribution et d’élimination des nanoparticules 146

V.1.1. Composition du sang 147

V.1.2. La circulation sanguine des nanoparticules 148

V.1.3. L’élimination des nanoparticules du sang 149

V.2. Compatibilité ex vivo entre le sang et les nano-émulsions 154

V.2.1. Stabilité de la fluorescence des nano-émulsions en milieu sanguin 154

V.2.2. Stabilité des globules rouges en présence de nano-émulsions 157

V.2.3. Conclusions 159

V.3. Etude de la biodistribution des nanoparticules sur souris saine 159

V.3.1. Evolution de la biodistribution des nanoparticules en fonction du temps 160

V.3.2. Evolution de la biodistribution en fonction de la formulation 170

V.4. Conclusion 176

Chapitre VI :  
Nano-émulsions fonctionnalisées pour la détection des tumeurs 179


VI.1. Les tumeurs, considérations générales 180

VI.1.1. Description 180

VI.1.2. L’angiogénèse, un phénomène clé dans le développement et la détection des tumeurs 181

VI.2. Le ciblage des tumeurs 184

VI.2.1. Le couple ligand / récepteur 184

VI.2.2. Le couplage chimique des ligands sur les nanoparticules 187

VI.2.3. Préparation de nano-émulsions fonctionnalisées 189

VI.3. Les modèles tumoraux et validation in vitro 195

VI.3.1. Modèles de cellules tumorales 195

VI.3.2. Test in vitro de reconnaissance cellulaire des nanoparticules - cRGD 196

VI.4. Ciblage actif des tumeurs in vivo 199

VI.4.1. Mise en évidence de l’effet EPR (« Enhanced Permeation and Retention ») 199

VI.4.2. Expérimentation in vivo : première série 201

VI.4.3. Expérimentation in vivo : deuxième série 204

VI.4.4. Conclusions 209

VI.5. Modèle de cellules tumorales HEK β3 209

VI.5.1. Protocole expérimental 210

VI.5.2. Résultats 210

VI.5.3. Discussion 213

VI.6. Conclusions 214

Conclusion générale 217

Chapitre VII : Bibliographie 225

Annexes 235

Annexe I : Matériels 236

Annexe II : Dispositifs de mesure 237

Spectres d’absorption 237

Spectres d’émission 237

Diffusion quasi-élastique de la lumière 237

Potentiel zêta 237

Durée de vie de fluorescence (Fluorophore : DiD) 238

Durée de vie de fluorescence (Fluorophore : DiR) 238

Annexe III : Paramètres de sonication 239

Annexe IV : Préparation d’une nano-émulsion non dopée issue de la formulation de référence 240

Annexe V : Préparation d’une nano-émulsion fluorescente issue de la formulation de référence 241

Annexe VI : Synthèse du surfactant réactif : PE-PEG-MAL 242

Annexe VII : Préparation d’une nano-émulsion fluorescente issue de la formulation à 2,5 % m/m de surfactant fonctionnalisable 243

Annexe VIII : Protocoles cellulaires 245

Cultures cellulaires 245

Analyse par cytométrie en flux 245

Analyse par microscopie de fluorescence 246
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